谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用（三） 以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物

2.3 重组菌全细胞转化制备GABA的谷氨杆菌工艺优化

2.3.1 温度对重组菌全细胞转化生产CABA的影响

酶法制备GABA是一个不可逆反应，适宜的酸脱羧酶温度可以使GABA转化率达到最大，所以通过设置不同的枯草酶转化温度来探究温度对GABA转化率的影响。以100g/L的芽孢用谷氨酸为底物，溶于去离子水中，表达加入湿菌体(在55℃水浴锅预处理50min，谷氨杆菌改善细胞膜的酸脱羧酶通透性)30U/g，在150r/min的枯草水浴摇床中进行转化，反应过程中，芽孢用控制pH为5.0。表达温度梯度设置为25、谷氨杆菌30、酸脱羧酶35、枯草40、芽孢用45、表达50℃，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图9。转化率随温度升高逐渐提高.当转化温度达到40℃时，GAD-0和GAD-PL转化率达到最高，分别为64.78％和82.27％，继续升高温度，转化率反而降低。这是因为枯草芽孢杆菌细胞壁厚，而反应温度过低时，底物与胞内酶液无法充分接触使得转化率低：当反应温度过高时，酶与PLP稳定性差，从而影响GABA的转化率。

2.3.2 DH对重组菌全细胞转化生产GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物.溶于去离子水中，加入预处理过的湿菌体30U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床巾进行转化，反应过程中，每隔2h用0.6mol/L的H₂S0₄或NaOH调节pH，使其始终与初始pH保持一致。pH梯度设置为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，反应24h后终止反应并进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图10，当pH为4.5或5.0时，GABA转化率最高，GAD-0的GABA转化率为75.45％和76.21％，GAD-PL的GABA转化率为84.54％和84.21％。当DH小于4.5时，底物-水谷氨酸钠在酸性条件下容易酸水解生成谷氨酸析出，从而形成乳白色浑浊液体.不利于酶与底物的充分结合；当pH大于5.0时不利于酶活性巾心的赖氨酸残基以shifft-碱与PLP、底物结合，从而抑制GABA的生成。可见，酶转化法制备GABA的pH耐受范围窄，过酸或过碱都不利于酶促反应进行，考虑在高质量浓度底物下，过低的pH更容易导致底物析出，所以酶转化最适pH为5.0。

2.3.3 加菌量对重组菌全细胞转化生产GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体(20、30、40、50、60U/g)，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制pH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用氨基酸柱前衍生法进行HPLC检测。结果见图11，重组菌全细胞转化率随着加菌量的增加而逐渐提高，其中GAD-PL和GAD-0分别在40U/g和50U/g时将底物完全转化，转化率达到100％。GAD-PL的加菌量少于GAD-0是因为前者细胞巾的PLP含量高于后者，PLP作为辅助因子有利于酶促反应的进行。
 

2.3.4 反应时间对重组茵全细胞转化生严GABA的影响

以100g/L的谷氨酸为底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL加入量分别为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应24h，反应过程中，控制DH为5.0。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测，结果见图12。在0～20h，GAD-0和GAD-PL转化合成GABA的产量随时问延长迅速增加，在20h时转化率达到100％，之后随着反应进行，转化率不再发生变化。

2.3.5 底物质量浓度对重组菌全细胞转化生严GABA的影响

以200g/L的谷氨酸为初始底物，溶于去离子水中，加入预处理过的不同湿菌体，GAD-0和GAD-PL力口菌量分另0为50U/g和40U/g，在40℃、150r/min的水浴摇床中反应6h后，每隔3h补加1.27g的谷氨酸同体至底物质量浓度分别为200、250、300、350、400g/L，反应过程中，控制pH为5.0，反应48h。反应结束后进行煮沸处理，12000r/min离心5min得上清液，适当稀释并过0.22μm有机滤膜后用HPLC-OPA柱前衍生法进行检测。结果见图13，当底物质量浓度达到400g/L谷氨酸时，GAD-0和GAD-PL转化生产GABA的转化率分别从100％(底物质量浓度350g/L谷氨酸)下降为97.72％和98.43％。综合考虑，为提高工业生产效率和节省下游分离纯化成本，选择350g/L作为酶法制备GABA的最适底物质量浓度。

3 结语

作者成功构建并重组表达了含有Escherichiacoli来源的gadB基因的重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。实验表明在发酵过程中添加0.5mmol/L辅酶前体PL的GAD总酶活达到28.14U/mL，是对照总酶活的1.72倍。进一步优化重组菌全细胞酶法生产GABA的工艺条件，结果表明，当温度为40℃，pH为5.0，GAD-0和GAD-PL的最适加菌量分别为50U/g和40U/g时，GABA转化率达到100％。当谷氨酸质量浓度为400g/L时，GABA产量分别为275.60扎和273.61g/L。综上所述，作者考察了菌体发酵培养过程中添加辅酶前体PL对重组菌产GAD及制备GABA的影响，开发了一种不需要在发酵过程和酶转化体系巾添加昂贵辅酶PLP就能高效生产GABA的T艺技术，为GABA在食品和医药行业中的广泛应用打下了坚实基础。

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